Vì lý do nào trong số những lý do này sẽ không sử dụng phương pháp phân tử

PCR thời gian thực (PCR định lượng, qPCR) hiện là một phương pháp được thiết lập tốt để phát hiện, định lượng và phân loại các tác nhân vi sinh vật khác nhau trong các lĩnh vực chẩn đoán lâm sàng, thú y và an toàn thực phẩm. Mặc dù khái niệm về PCR tương đối đơn giản, nhưng có những vấn đề cụ thể trong qPCR mà các nhà phát triển và người sử dụng công nghệ này phải ghi nhớ. Chúng bao gồm việc sử dụng thuật ngữ và định nghĩa chính xác, hiểu nguyên tắc PCR, những khó khăn trong việc giải thích và trình bày dữ liệu, những hạn chế của qPCR trong các lĩnh vực chẩn đoán vi khuẩn khác nhau và các thông số quan trọng đối với mô tả hiệu suất của qPCR. Mục đích của chúng tôi trong bài đánh giá này không phải là mô tả mọi khía cạnh đơn lẻ của thiết kế, tối ưu hóa và xác thực qPCR;

Giới thiệu

Cụm từ “phản ứng chuỗi polymerase” (PCR) lần đầu tiên được sử dụng cách đây hơn 30 năm trong một bài báo mô tả quá trình khuếch đại DNA mới bằng enzyme (). Các ứng dụng đầu tiên của PCR khá phi thực tế do sử dụng đoạn Klenow không bền nhiệt để khuếch đại, đoạn này cần được thêm vào phản ứng sau mỗi bước biến tính. Sự đổi mới quan trọng cho phép sử dụng PCR thường xuyên là sử dụng polymerase ổn định nhiệt từ Thermus Aquaus (). Sự cải tiến này, cùng với sự sẵn có của các chu trình PCR và các thành phần hóa học, đã dẫn đến việc PCR được toàn thế giới công nhận là công cụ được lựa chọn để khuếch đại DNA bằng enzym cụ thể trong ống nghiệm. Cần lưu ý rằng khái niệm chung về PCR, bao gồm mồi, DNA polymerase, nucleotide, ion cụ thể và khuôn mẫu DNA, và bao gồm các chu kỳ bao gồm các bước biến tính DNA, ủ mồi và mở rộng, đã không thay đổi kể từ năm 1985. Việc phát minh ra PCR đã thúc đẩy mạnh mẽ nghiên cứu trong các lĩnh vực sinh học khác nhau và công nghệ này đã góp phần đáng kể vào trình độ hiểu biết hiện tại của con người trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu.

Cột mốc quan trọng nhất trong việc sử dụng PCR là sự ra đời của khái niệm giám sát quá trình khuếch đại DNA trong thời gian thực thông qua giám sát huỳnh quang (; ). Trong PCR thời gian thực (còn được ký hiệu là PCR định lượng—qPCR; việc sử dụng RT-PCR là không phù hợp vì chữ viết tắt này được dành riêng cho PCR phiên mã ngược), huỳnh quang được đo sau mỗi chu kỳ và cường độ của tín hiệu huỳnh quang phản ánh lượng DNA nhất thời . Trong các chu kỳ ban đầu, huỳnh quang quá thấp để có thể phân biệt được với nền. Tuy nhiên, điểm mà tại đó cường độ huỳnh quang tăng trên mức có thể phát hiện được tương ứng với số lượng ban đầu của phân tử DNA mẫu trong mẫu. Điểm này được gọi là chu kỳ định lượng (Cq; các nhà sản xuất thiết bị qPCR khác nhau sử dụng thuật ngữ riêng của họ, nhưng kể từ năm 2009, thuật ngữ Cq được sử dụng riêng) và cho phép xác định số lượng tuyệt đối của DNA đích trong mẫu theo đường chuẩn được xây dựng

Hơn nữa, qPCR cũng có thể cung cấp kết quả bán định lượng mà không cần tiêu chuẩn nhưng có kiểm soát được sử dụng làm tài liệu tham khảo. Trong trường hợp này, các kết quả quan sát có thể được biểu thị dưới dạng bội số cao hơn hoặc thấp hơn với tham chiếu đến kiểm soát. Ứng dụng này của qPCR đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu biểu hiện gen (), nhưng không đạt được thành công tương tự trong định lượng vi sinh vì nó không thể tạo ra các giá trị định lượng tuyệt đối

Có hai chiến lược để hiển thị thời gian thực các đoạn DNA được khuếch đại—thuốc nhuộm DNA huỳnh quang không đặc hiệu và mẫu dò oligonucleotide được đánh dấu huỳnh quang. Hai phương pháp này được phát triển song song (; ) và được sử dụng để phát hiện mầm bệnh; . Điều này là do tính đặc hiệu cao hơn của nó được trung gian bởi oligonucleotide bổ sung—đầu dò—và độ nhạy thấp hơn để hình dung các sản phẩm PCR không đặc hiệu, e. g. , bộ điều chỉnh độ sáng mồi (; )

Để hiểu đầy đủ các khả năng của qPCR trong việc phát hiện và định lượng DNA mục tiêu trong các mẫu, điều cần thiết là phải mô tả nguyên tắc toán học của phương pháp này. PCR là một quá trình theo cấp số nhân, trong đó số lượng phân tử DNA về mặt lý thuyết tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ (nếu hiệu suất của phản ứng là 100%). Tổng quát hơn, phản ứng khuếch đại tuân theo phương trình này

Nn = N0 × (1 + E)n    (1)

trong đó Nn là số lượng bộ khuếch đại PCR sau n chu kỳ, N0 là số bản sao khuôn mẫu ban đầu trong mẫu, E là hiệu suất PCR có thể nhận các giá trị trong khoảng từ 0 đến 1 (0–100%) và n là số . Trong trường hợp ban đầu có một bản sao của mẫu trong phản ứng và hiệu suất PCR là 100%, có thể đơn giản hóa phương trình như sau

Nn = 2n    (2)

Nếu chạy đường chuẩn, thường sử dụng pha loãng nối tiếp 10 lần. Sự khác biệt về giá trị Cq giữa hai độ pha loãng nối tiếp 10 lần có thể được biểu thị bằng

10= 2n    (3)

Khi đó n = 3. 322. Khi E nên được xác định (1) là điểm bắt đầu và phương trình là

E = 10−(1n) − 1    (4)

Nếu lấy n là 3. 322 thì E = 1, i. e. , 100%

Do đó, hiệu quả PCR là một yếu tố quan trọng để định lượng DNA mục tiêu trong các mẫu chưa biết. Độ tin cậy của đường chuẩn trong việc cho phép định lượng sau đó được xác định bởi khoảng cách của các độ pha loãng nối tiếp. Nếu Log10 của nồng độ hoặc số lượng bản sao của mỗi chất chuẩn được vẽ dựa trên giá trị Cq của nó (Hình 1), thì E có thể được suy ra từ phương trình hồi quy mô tả hàm tuyến tính

y = kx + c    (5)

Trong đó x và y lần lượt là nồng độ/lượng của mục tiêu và giá trị Cq, đặc trưng cho tọa độ trong biểu đồ, k là hệ số hồi quy hoặc độ dốc và c là hệ số chặn. Lấy phương trình hồi quy mô hình từ Hình , hệ số góc là −3. 322, nghĩa là E = 100% theo (4). Chặn hiển thị giá trị Cq khi một bản sao sẽ được phát hiện về mặt lý thuyết (; ). Sau đó, nồng độ hoặc lượng axit nucleic mục tiêu trong các mẫu chưa biết được tính theo giá trị Cq thông qua Công thức (5)

HÌNH 1

Hình 1. Lập mô hình đường chuẩn với phương trình hồi quy (đặc trưng bởi hệ số góc và tung độ gốc) và hệ số hồi quy

Từ các định nghĩa trên, rõ ràng là các giá trị Cq là số đọc của thiết bị và phải được tính toán lại thành các giá trị với các đơn vị cụ thể, e. g. , bản sao của sinh vật, ng của DNA, nồng độ khác nhau, v.v. , (; ). Tuy nhiên, việc đề cập đến các giá trị Cq trong các bài báo khoa học là phổ biến và việc giải thích dựa trên các giá trị Cq có thể dẫn đến kết luận sai lệch. Nồng độ trong qPCR được biểu thị theo thang logarit (Hình ) và sự khác biệt về Cq giữa các độ pha loãng nối tiếp 10 lần về mặt lý thuyết luôn là 3. 322 chu kỳ. Do đó, mặc dù sự khác biệt về số giữa Cq 20 và 35 là không đáng kể, nhưng sự khác biệt về số thực (bản sao, ng) gần bằng năm bậc độ lớn (Log10)

Tính năng này phải được phản ánh trong các tính toán tiếp theo. Ví dụ: hệ số biến thiên (CV, tỷ lệ giữa độ lệch chuẩn và giá trị trung bình) được tính toán từ các giá trị Cq và số thực dẫn đến các kết quả rất khác nhau. Điều tương tự cũng áp dụng cho bất kỳ thử nghiệm thống kê nào sử dụng giá trị Cq, ngay cả đối với trường hợp logarit của giá trị Cq được sử dụng để chuẩn hóa dữ liệu trước khi đánh giá thống kê. Quy trình đúng phải bao gồm phép tính lại ban đầu thành số thực, sau đó là phép biến đổi logarit

Ưu và nhược điểm của việc sử dụng qPCR trong phát hiện và định lượng mầm bệnh

Vì PCR có khả năng khuếch đại một đoạn DNA cụ thể nên nó đã được sử dụng trong chẩn đoán mầm bệnh. Với số lượng dữ liệu giải trình tự ngày càng tăng, theo nghĩa đen, có thể thiết kế các xét nghiệm qPCR cho mọi vi sinh vật (nhóm và phân nhóm vi sinh vật, v.v. ) lãi. Ưu điểm chính của qPCR là nó cung cấp khả năng phát hiện và định lượng nhanh và thông lượng cao các trình tự DNA mục tiêu trong các nền khác nhau. Thời gian khuếch đại thấp hơn được tạo điều kiện thuận lợi bằng cách khuếch đại đồng thời và trực quan hóa các bộ khuếch đại DNA mới được hình thành. Hơn nữa, qPCR an toàn hơn trong việc tránh lây nhiễm chéo vì không cần thao tác thêm với các mẫu sau khi khuếch đại. Các ưu điểm khác của qPCR bao gồm dải động rộng để định lượng (7–8 Log10) và ghép kênh khuếch đại của một số mục tiêu vào một phản ứng duy nhất (). Tùy chọn ghép kênh là điều cần thiết để phát hiện và định lượng trong các xét nghiệm qPCR chẩn đoán dựa trên việc bao gồm các điều khiển khuếch đại bên trong (; ; )

Các xét nghiệm qPCR không chỉ được sử dụng để phát hiện mà còn để xác định sự hiện diện của các gen và alen cụ thể, chẳng hạn như. g. , định loại chủng và phân lập, lập hồ sơ kháng kháng sinh, sản xuất độc tố, v.v. , Tuy nhiên, sự hiện diện đơn thuần của các gen chịu trách nhiệm kháng các hợp chất chống vi trùng hoặc sản xuất độc tố nấm không tự động có nghĩa là chúng biểu hiện hoặc sản xuất. Do đó, mặc dù các bài kiểm tra đánh máy dựa trên qPCR nhanh hơn nhưng kết quả của chúng phải tương quan với các bài kiểm tra kiểu hình và sinh hóa (; )

Đối với chẩn đoán vi sinh vật, có những cân nhắc khác nhau trong việc phát hiện và định lượng các tác nhân vi rút, vi khuẩn và ký sinh trùng. Những cân nhắc này dựa trên mục tiêu (DNA hoặc RNA), khả năng nuôi cấy, giải thích kết quả và ý nghĩa lâm sàng của kết quả qPCR

qPCR đóng một vai trò quan trọng trong việc phát hiện, định lượng và định loại mầm bệnh virus. Điều này là do việc phát hiện các loại vi rút lâm sàng và thú y quan trọng bằng phương pháp nuôi cấy là tốn thời gian hoặc không thể, trong khi các xét nghiệm ELISA không phổ biến và có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đối thấp. qPCR (bao gồm phiên mã ngược để chẩn đoán virus RNA) cung cấp độ nhạy và độ đặc hiệu thích hợp (). Ngoài ra, việc xác định tải lượng vi-rút bằng (RT)-qPCR được sử dụng như một chỉ báo về đáp ứng với các liệu pháp kháng vi-rút (). Vì những lý do này (RT)-qPCR đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong chẩn đoán virus ()

Tình hình tương tự trong trường hợp chẩn đoán đơn bào đường ruột (). Kỹ thuật tiêu chuẩn vàng để phát hiện các tác nhân đơn bào, kiểm tra phân bằng kính hiển vi, tốn nhiều công sức, thời gian và yêu cầu nhân viên được đào tạo đặc biệt. Tương tự, xét nghiệm ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp (). Do đó, qPCR hiện đang nổi lên như một công cụ mạnh mẽ trong việc phát hiện, định lượng và định loại các động vật nguyên sinh ký sinh đường ruột.

Trái ngược với việc phát hiện và định lượng virus và động vật nguyên sinh, nhiều loại vi khuẩn có ý nghĩa lâm sàng, thú y và an toàn thực phẩm có thể được nuôi cấy. Vì lý do này, nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn vàng trong phát hiện và định lượng vi khuẩn. Tuy nhiên, trong những trường hợp cần can thiệp quan trọng và kịp thời đối với bệnh truyền nhiễm, các kỹ thuật nuôi cấy truyền thống, chậm và nhiều bước không thể mang lại kết quả trong thời gian hợp lý. Hạn chế này được kết hợp bởi sự cần thiết phải nuôi cấy mầm bệnh khó tính và thử nghiệm bổ sung (xác định loài, xác định các yếu tố độc lực và kháng thuốc kháng sinh). qPCR có khả năng cung cấp thông tin cần thiết trong thời gian ngắn;

Về an toàn thực phẩm, tất cả các tiêu chuẩn quốc tế về chất lượng thực phẩm đều dựa vào việc xác định vi sinh vật gây bệnh bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống. Các kỹ thuật qPCR đại diện cho một giải pháp thay thế tuyệt vời cho các phương pháp nuôi cấy tiêu chuẩn hiện có vì chúng cho phép phát hiện và định lượng đáng tin cậy (đối với một số mầm bệnh) và có nhiều lợi thế khác như đã thảo luận ở trên. Tuy nhiên, có những hạn chế liên quan đến độ nhạy của các xét nghiệm dựa trên qPCR. Vì các phương pháp nuôi cấy dựa vào sự nhân lên của vi khuẩn trong các bước tiền nuôi cấy (tiền tăng sinh), các mẫu để phân lập DNA ban đầu thường chứa số lượng vi khuẩn mục tiêu rất thấp (). Hạn chế này dẫn đến nhược điểm quan trọng nhất của qPCR, đó là khả năng phân biệt giữa tế bào sống và tế bào chết vốn có của nó. Do đó, việc sử dụng qPCR chỉ giới hạn trong việc phân loại các chủng vi khuẩn, xác định khả năng kháng kháng sinh, phát hiện và có thể định lượng trong thực phẩm thô và chưa chế biến. Điều quan trọng cần lưu ý là thực phẩm đã qua chế biến vẫn có thể chứa DNA có thể khuếch đại ngay cả khi tất cả các vi khuẩn có khả năng gây bệnh trong thực phẩm đã bị khử và thực phẩm an toàn về mặt vi sinh để tiêu thụ (). Để khắc phục vấn đề này, có thể đặt tiền tăng sinh mẫu trong môi trường nuôi cấy trước qPCR. Bước này có thể bao gồm tăng sinh không chọn lọc trong nước đệm peptone hoặc môi trường chọn lọc cụ thể cho vi khuẩn tương ứng. Quy trình này chủ yếu nhằm mục đích cho phép hồi sức/phục hồi và nhân lên sau đó của vi khuẩn để phát hiện qPCR xuôi dòng; . ). Việc chiết xuất DNA từ môi trường nuôi cấy dễ dàng hơn so với từ các mẫu thực phẩm, chúng không đồng nhất hơn nhiều về thành phần ()

Mặc dù bản thân qPCR không thể phân biệt giữa các tế bào chết và tế bào sống, các nỗ lực đã được thực hiện để điều chỉnh qPCR nhằm phát hiện khả năng sống. Người ta đã chứng minh rằng RNA có độ ổn định thấp và sẽ bị phân hủy trong các tế bào chết trong vòng vài phút. Tuy nhiên, mối tương quan giữa khả năng tồn tại của tế bào với sự tồn tại của các loại axit nucleic phải được đặc trưng rõ ràng cho một tình huống cụ thể trước khi phương pháp phân tích dựa trên khuếch đại thích hợp có thể được áp dụng làm phương pháp thay thế cho các kỹ thuật nuôi cấy truyền thống hơn (). Hơn nữa, những khó khăn liên quan đến việc phân lập RNA từ các mẫu như thực phẩm, phân hoặc mẫu môi trường có thể cho kết quả âm tính giả, đặc biệt khi số lượng tế bào đích dự kiến ​​thấp

Một tùy chọn khác để xác định khả năng tồn tại bằng cách sử dụng qPCR là triển khai thuốc nhuộm huỳnh quang xen kẽ như propidium monoazide (PMA) và ethidium monoazide (EMA; ). Trong các phương pháp này, tiêu chí để xác định khả năng tồn tại là tính toàn vẹn của màng. Các tế bào hoạt động trao đổi chất (bất kể khả năng nuôi cấy của chúng) với tính toàn vẹn của màng giữ cho thuốc nhuộm bên ngoài tế bào và do đó được coi là khả thi. Tuy nhiên, nếu tính toàn vẹn của màng sinh chất bị tổn hại, thuốc nhuộm sẽ thâm nhập vào tế bào hoặc phản ứng với DNA bên ngoài tế bào chết. Sau đó, DNA được dán nhãn không có sẵn để khuếch đại bởi qPCR và sự khác biệt giữa các tế bào được xử lý và không được xử lý cung cấp thông tin về tỷ lệ các tế bào khả thi trong mẫu. Hạn chế của phương pháp này là cần phải có các ô trong một ma trận trong suốt ánh sáng, e. g. , mẫu nước, nuôi cấy tế bào, v.v. , vì sự xen kẽ của thuốc nhuộm với DNA đòi hỏi phải tiếp xúc với ánh sáng. Do đó, các mẫu không đủ độ trong suốt ánh sáng không cho phép sử dụng các thuốc nhuộm này. Người ta ưu tiên PMA hơn EMA, vì người ta đã chứng minh rằng EMA thâm nhập vào màng tế bào vi khuẩn sống ()

Ngoài ra, một chủ đề khác mà chúng tôi muốn đề cập ở đây là việc tạo ra và sử dụng các tiêu chuẩn cần thiết cho các đường chuẩn. Nói chung, có hai cách tiếp cận phổ biến nhất để tạo ra các đường chuẩn. Một sử dụng sự pha loãng của axit nucleic bộ gen mục tiêu và các tiêu chuẩn plasmid khác. Cả hai chiến lược đều có thể dẫn đến định lượng mục tiêu cuối cùng, nhưng các plasmid chứa trình tự mục tiêu cụ thể mang lại lợi thế là sản xuất dễ dàng, ổn định và rẻ. Mặt khác, về nguyên tắc, hiệu quả PCR thu được theo tiêu chuẩn plasmid đôi khi có thể khác so với hiệu quả thu được khi sử dụng tiêu chuẩn gen, mà thay vào đó, đối với các sinh vật khó phát triển, chỉ có thể được phân lập bắt đầu từ một chất nền nhất định và do đó dễ bị phân hủy. . Cuối cùng, việc sản xuất và xác nhận các tiêu chuẩn định lượng quốc tế cho các xét nghiệm qPCR đòi hỏi kỹ thuật cao và các tiêu chuẩn này hiện chỉ khả dụng cho một số mục tiêu ()

Thông số qPCR trong Phát hiện và Định lượng Vi sinh vật

Độ đặc hiệu phân tích (Tính chọn lọc)

Tham số này trong qPCR đề cập đến tính đặc hiệu của đoạn mồi cho mục tiêu quan tâm. Tính đặc hiệu phân tích bao gồm hai khái niệm. tính toàn diện mô tả khả năng của phương pháp phát hiện nhiều loại mục tiêu với mức độ liên quan được xác định e. g. , phân loại, miễn dịch, thành phần di truyền (, ). Một định nghĩa khác mô tả tính toàn diện là các chủng hoặc phân lập của (các) chất phân tích đích mà phương pháp có thể phát hiện (). ISO 16140 và các tiêu chuẩn khác khuyến nghị rằng tính bao gồm nên được xác định trên 20–50 chủng được xác định rõ (được chứng nhận) của sinh vật đích (, , , ; ), hoặc đối với Salmonella, khuyến nghị nên bao gồm 100 serovar để thử nghiệm tính bao gồm (

Mặt khác, tính độc quyền mô tả khả năng của phương pháp phân biệt mục tiêu với các mục tiêu không phải là mục tiêu tương tự nhưng khác biệt về mặt di truyền. Nói cách khác, tính độc quyền cũng có thể được định nghĩa là không có sự can thiệp từ một loạt các chủng không phải mục tiêu có liên quan, có khả năng phản ứng chéo ( , , , ). Số lượng mẫu dương tính mong muốn trong xét nghiệm độc quyền là 0 ()

Độ nhạy phân tích (Giới hạn phát hiện, LOD)

Nhiều tài liệu chính thức đã thảo luận về các lý thuyết và quy trình để định nghĩa chính xác LOD cho các phương pháp khác nhau. Một sự đồng thuận chung đã đạt được xung quanh định nghĩa LOD là lượng chất phân tích thấp nhất, có thể được phát hiện với độ tin cậy cao hơn một tỷ lệ phần trăm đã nêu, nhưng không nhất thiết phải được định lượng thành một giá trị chính xác (, , ). Về vấn đề này, mức độ tin cậy đạt được hoặc được yêu cầu cho định nghĩa LOD có thể phản ánh số lần lặp lại (cả kỹ thuật và thử nghiệm) mà xét nghiệm cần để đạt được mức độ tin cậy được yêu cầu (e. g. , 95%). Rõ ràng là càng nhiều lần lặp lại thì khoảng tin cậy càng hẹp. Một định nghĩa khác mô tả LOD là mức nồng độ thấp nhất có thể được xác định là khác biệt về mặt thống kê so với mẫu trắng ở mức độ tin cậy xác định. Giá trị này phải được xác định từ việc phân tích mẫu trắng và mẫu ở các mức gần LOD dự kiến ​​(). Tuy nhiên, cần lưu ý rằng các định nghĩa LOD được mô tả ở trên đã được báo cáo cho các phương pháp hóa học và không hoàn toàn phù hợp với các phương pháp PCR (). Điều này là do, đối với nồng độ giới hạn của chất phân tích (axit nucleic), đầu ra của phản ứng có thể thành công (khuếch đại) hoặc thất bại (không khuếch đại gì cả), không có mẫu trắng hoặc mức tới hạn nào có thể đạt được. . Hơn nữa, cần nhớ ở đây rằng, theo định nghĩa, một mẫu trắng không bao giờ dương tính trong PCR.

Vì các định nghĩa được báo cáo ở trên không thể thực hiện được đối với PCR, nên các phương pháp khác đã được đề xuất. Một cách tiếp cận thận trọng là coi giá trị LOD là nồng độ tối thiểu của axit nucleic hoặc số lượng tế bào, luôn cho kết quả PCR dương tính trong tất cả các lần lặp lại được thử nghiệm hoặc trong phần lớn (hơn 95%) trong số chúng (). Trong thực tế, nhiều phần của một chất nền cụ thể được thêm vào các độ pha loãng nối tiếp của sinh vật đích và trải qua toàn bộ quá trình phân lập axit nucleic và qPCR. Sau đó, LOD được định nghĩa là lượng vi sinh vật đích tăng đột biến ở dạng pha loãng có thể được phát hiện trong 95% số lần lặp lại. Ví dụ, 10 mẫu sữa lặp lại được bổ sung thêm Campylobacter jejuni pha loãng nối tiếp với số lượng 105–100 tế bào trên 1 ml sữa. LOD được xác định bằng thực nghiệm của phương pháp phát hiện C. jejuni trong sữa xấp xỉ 1. 56 × 103 tế bào/ml sữa (Hình ). Để xác định rõ hơn giá trị chính xác nhất, có thể thử nghiệm nhiều độ pha loãng hơn trước khi đạt đến giá trị LOD cuối cùng càng gần giá trị thực càng tốt. Số lần lặp lại thử nghiệm ít nhất phải là sáu (; );

HÌNH 2

Hình 2. Biểu diễn đồ họa của việc xác định giới hạn phát hiện (LOD) trong qPCR. Dữ liệu trong bảng hiển thị số lượng mẫu dương tính/tất cả các mẫu được phân tích (tỷ lệ tín hiệu)

Theo phân phối Poisson, người ta kết luận rằng LOD cho PCR không thể thấp hơn ít nhất ba bản sao của mục tiêu axit nucleic (; ). Tuy nhiên, giá trị này đề cập đến LOD lý thuyết của phương pháp qPCR, có khả năng phát hiện một phân tử DNA đích duy nhất trong mẫu. Giả sử điều này, LOD như vậy cho tất cả các xét nghiệm qPCR được tối ưu hóa sẽ giống nhau. Do đó, như đã nêu ở trên, LOD phải liên quan đến toàn bộ phương pháp bao gồm chuẩn bị axit nucleic và qPCR. Chỉ trong những điều kiện này, nó mới có thể biểu thị một tham số hợp lệ mô tả các tính năng của phương pháp qPCR tương ứng ()

Tuy nhiên, đôi khi không thể có được số lượng lớn các bản sao, vì cả lý do tài chính và kỹ thuật. Để khắc phục những vấn đề này, ngày càng có nhiều báo cáo sử dụng phương pháp Probit hoặc Logit để xác định LOD cho phương pháp PCR (; ; ;). Tóm lại, cả hai hàm toán học đều là hồi quy được sử dụng để phân tích các biến phản ứng nhị thức (dương hoặc âm) và có thể biến đổi đường cong phản ứng liều lượng sigmoid, điển hình của một biến nhị thức, thành một đường thẳng mà sau đó có thể được phân tích bằng hồi quy thông qua ít nhất . Điểm cuối cùng của phân tích là nồng độ (cùng với khoảng tin cậy tương đối), liên quan đến xác suất (e. g. , 95%) để phát hiện axit nucleic. Hơn nữa, hồi quy Probit chỉ có thể khai thác đối với dữ liệu được phân phối bình thường, trong khi chức năng Logit cũng có thể được sử dụng cho dữ liệu không được phân phối bình thường;

Cuối cùng, cần lưu ý rằng LOD không phải là giá trị giới hạn và do đó, các giá trị Cq bên dưới LOD không thể tự động được coi là âm. Từ định nghĩa của LOD, rõ ràng là các giá trị bên dưới LOD hoàn toàn hợp lệ về sự hiện diện của vi sinh vật; . Tính năng này được kết nối với phân phối Poisson khi làm việc với số lượng nhỏ

Giới hạn định lượng (LOQ)

Các tài liệu đã được trích dẫn cho các định nghĩa LOD cũng chứa các định nghĩa tương tự cho LOQ. LOQ được định nghĩa là lượng chất phân tích nhỏ nhất, có thể được đo và định lượng với độ chính xác và độ chính xác xác định trong các điều kiện thí nghiệm bằng phương pháp được xác nhận (; , ). Một định nghĩa khác là LOQ là lượng hoặc nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể được xác định định lượng với mức độ không chắc chắn có thể chấp nhận được (). Rõ ràng là, theo các định nghĩa trước đó, LOQ không bao giờ được thấp hơn LOD

Trong thực tế, LOQ được xác định giống như LOD, trên các bản sao của các mẫu thêm chuẩn, nhưng việc đánh giá kết quả là định lượng. Về số lượng, LOQ được định nghĩa là nồng độ thấp nhất của chất phân tích, mang lại độ biến thiên được xác định trước, thường được báo cáo là hệ số biến thiên (CV). Đối với qPCR, giá trị này đã được đề xuất cố định dưới 25% (; ; ; ), lưu ý rằng các giá trị Cq phải được tính toán lại cho các bản sao hoặc g axit nucleic trước khi thực hiện đánh giá CV (; ). Hoverer, giá trị này được đề xuất dựa trên kinh nghiệm tích lũy được trong các phòng thí nghiệm phát hiện GMO (; ) và không có thỏa thuận chung nào về bất kỳ tiêu chuẩn kỹ thuật nào đối với các phương pháp phân tử trong vi sinh học. Do đó, ở đây chúng tôi đề xuất định nghĩa LOQ trong chẩn đoán phân tử vi sinh vật là nồng độ, số lượng hoặc số lượng chất phân tích thấp nhất có CV <25%

Một cách tiếp cận khác để xác định LOQ của qPCR dựa trên việc sử dụng chỉ số Youden (J) và các đường cong đặc tính vận hành máy thu (). Chỉ số cuối cùng này được định nghĩa là J = độ nhạy + độ đặc hiệu −1 (). Một loạt các mẫu được thêm vào với nồng độ DNA mục tiêu khác nhau đã được phân tích và giá trị J được tính toán cho mỗi chu kỳ PCR. LOQ sau đó được cố định là nồng độ DNA có giá trị J cao nhất ()

Cuối cùng, một vấn đề cần được giải quyết để xác định LOQ cũng như LOD là hiệu quả thu hồi các phân tử mục tiêu trong các giai đoạn tách chiết axit nucleic. Nói chung, axit nucleic được chiết xuất từ ​​các chất nền phức tạp khác nhau, như thực phẩm, phân hoặc các mẫu khác bằng các quy trình khác nhau. Hiệu suất thu hồi DNA thường vào khoảng 30% và thấp hơn (; ; ) và việc bỏ qua tham số này dẫn đến đánh giá thấp số lượng vi sinh vật mục tiêu thực sự trong mẫu ban đầu, sau đó được phản ánh bởi các giá trị LOD và LOQ thấp hơn. Do đó, việc xác định hiệu quả phân lập DNA phải là một phần của LOD và LOQ. Hiệu suất phân lập DNA là thương số giữa số lượng vi sinh vật được phục hồi sau toàn bộ quy trình (chiết xuất axit nucleic + qPCR) và số lượng vi sinh vật được sử dụng để tạo mẫu cho nền âm tính (; ; ). Do những dữ liệu này được cung cấp trong quá trình xác định LOD và LOQ nên không cần thiết phải thực hiện thêm các thí nghiệm. Khuyến cáo rằng giá trị trung bình của các giá trị phân lập DNA trung bình từ các độ pha loãng khác nhau được sử dụng làm hiệu quả phân lập DNA tổng thể thực tế ()

Tương tự như LOD, số lượng cũng có thể được đánh giá trong các mẫu có số lượng sinh vật hoặc nồng độ DNA thấp hơn LOQ, nhưng độ tin cậy của phép định lượng đó sẽ thấp hơn độ tin cậy được công bố theo định nghĩa của LOQ. Hơn nữa, có những khả năng về cách đề cập đến những đại lượng như vậy theo cách giải thích bán định lượng, e. g. , phạm vi giá trị (102–101 ô/g)

Hiệu quả khuếch đại của qPCR (E)

Tham số này đã được đề cập ở trên trong phần dành riêng cho mô tả toán học của qPCR (Phương trình 4). Hiệu quả PCR phải nằm trong khoảng 0–1 (0–100%); . Điều này khó đạt được lặp đi lặp lại theo thời gian. Trên thực tế, tham số này có thể nằm trong khoảng 90–105% (). Thông số này có thể được ước tính từ độ dốc của đường chuẩn

Liên quan đến vấn đề này, nồng độ thấp nhất và cao nhất của chất chuẩn có trong đường chuẩn, có thể thực sự định lượng được, nên được xác định theo dải động tuyến tính ít nhất trên 6 Log10. Phạm vi động được xác định theo hướng dẫn MIQE là phạm vi mà phản ứng là tuyến tính ()

Việc xác định hiệu quả PCR bằng đường chuẩn thực sự cung cấp hai thông tin. Nếu một chất ức chế có mặt trong mẫu cô đặc nhất, thì sẽ có sự gia tăng rõ rệt về giá trị Cq trong những mẫu này và do đó làm giảm 3. Khoảng 322 Cq ở nồng độ cao hơn. Tuy nhiên, đây không phải là một hiện tượng thường xuyên, vì các tiêu chuẩn thường được đặc trưng rõ ràng và do đó, bất kỳ sự ức chế nào cũng khó xảy ra. Nếu xảy ra tình huống tương tự trong các mẫu có nồng độ thấp hơn, điều này cho thấy có thể xảy ra lỗi pipet hơn là sự hiện diện của chất ức chế. Một chức năng quan trọng để đánh giá điều này là hệ số xác định (giá trị R2), phải cao hơn 0. 98 (). Trên thực tế, điều quan trọng hơn nhiều là xác định sự ức chế PCR và sự giảm hiệu quả PCR sau đó trong các mẫu được phân tích. Có các phương pháp dựa trên phân tích đường cong huỳnh quang của từng mẫu bằng phần mềm cụ thể (LinRegPCR), có thể tính toán hiệu quả PCR của từng mẫu mà không cần pha loãng hàng loạt. Tuy nhiên, cách tiếp cận này không hoàn hảo vì nó không tính đến tất cả các biến có thể ảnh hưởng đến phân tích ()

Độ chính xác của PCR

Các tham số sau đây của qPCR xử lý các cách so sánh các phương pháp qPCR mới với các phương pháp hoặc tài liệu tham khảo. Độ chính xác được định nghĩa là thước đo mức độ phù hợp của một giá trị được tạo ra bởi một quy trình cụ thể với giá trị thực được giả định hoặc chấp nhận (). Nói cách khác, độ chính xác mô tả mức độ phù hợp giữa giá trị tham chiếu và giá trị đo được. Có một số khía cạnh cần được xem xét về mặt xác định độ chính xác. Trong các xét nghiệm phân loại nhị phân (phát hiện định tính), các mẫu được phân tích bằng xét nghiệm mới (thay thế) cần được xác minh (thường là xét nghiệm qPCR mới) được phân loại theo sự phù hợp của chúng với phương pháp tham chiếu trong bốn loại cơ bản (Bảng 1). Sự phân chia này bắt nguồn từ phân loại thống kê được gọi là ma trận lỗi và cho phép xác định một số thông số mô tả tiềm năng chẩn đoán của phương pháp qPCR

BẢNG 1

Bảng 1. Các tham số để so sánh kết quả qPCR với phương pháp tham chiếu trong bảng dự phòng ma trận lỗi 2 × 2

Độ nhạy chẩn đoán, được mô tả là TP/(TP + FN), đề cập đến khả năng xét nghiệm mới xác định chính xác các mẫu được xác định bằng phương pháp tham chiếu là dương tính. Độ nhạy chẩn đoán càng thấp, khả năng bao gồm của qPCR được thử nghiệm càng kém. Một lời giải thích khác có thể là độ nhạy phân tích (LOD) của phương pháp tham chiếu cao hơn qPCR đã thử nghiệm

Độ đặc hiệu chẩn đoán được định nghĩa là TN/(TN + FP) và đề cập đến khả năng xét nghiệm xác định chính xác các mẫu được phát hiện là âm tính bằng phương pháp tham chiếu. Độ đặc hiệu chẩn đoán càng thấp thì tính độc quyền của qPCR được thử nghiệm càng kém. Một lời giải thích khác có thể là độ nhạy của phương pháp tham chiếu khá kém và phương pháp qPCR mới có khả năng xác định nhiều mẫu dương tính hơn phương pháp tham chiếu

Độ chính xác tương đối được định nghĩa là (TP + TN)/(TP + TN + FP + FN) và mô tả tỷ lệ tất cả các mẫu được xác định chính xác trong số tất cả các mẫu (). Nếu không phát hiện thấy FN và FP thì là 100%. Trong tất cả các trường hợp khác, giá trị này thấp hơn 100%

Trong xác định định lượng, độ chính xác mô tả bằng số khoảng cách của giá trị từ qPCR được thử nghiệm mới và một số giá trị tham chiếu (đúng). Vì lý do này, độ chính xác được gọi là độ đúng trong phân loại định lượng (). Độ đúng được định nghĩa là mức độ phù hợp của giá trị kỳ vọng với giá trị thực hoặc giá trị tham chiếu được chấp nhận. Điều này liên quan đến lỗi hệ thống (,). Trong thử nghiệm GMO, độ đúng phải nằm trong khoảng 25% giá trị tham chiếu được chấp nhận (). Không có giá trị cố định nào về độ đúng mà phương pháp qPCR mới được thử nghiệm phải đáp ứng trong chẩn đoán vi sinh. Điều này có thể do thực tế là độ đúng trong qPCR có thể được xác định bằng cách so sánh với một số tài liệu tham khảo được chứng nhận, với phương pháp tham chiếu hoặc bằng thử nghiệm thành thạo. Vật liệu tham chiếu đã được chứng nhận với số lượng sinh vật đích được định lượng chỉ có sẵn cho một số lượng hạn chế các sinh vật (đặc biệt là các vi-rút như HIV, HBV, HCV, HAV, HPV, CMV, EBV), trong khi đối với các sinh vật có ý nghĩa lâm sàng còn lại, những vật liệu này là . Các phương pháp tham chiếu thường có độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán khác nhau và thường chúng không phù hợp với mục đích đánh giá định lượng các phương pháp qPCR mới. Hơn nữa, việc tổ chức thử nghiệm thành thạo thông qua thử nghiệm vòng là tốn kém và yêu cầu nhà cung cấp mẫu chuẩn (như QCMD). Đây là những lý do chính khiến việc xác định độ đúng của các phương pháp qPCR để phát hiện vi sinh vật trong lâm sàng, và đặc biệt là trong lĩnh vực an toàn thực phẩm thú y, còn khá hạn chế

Độ chính xác của qPCR

Độ chính xác được định nghĩa là mức độ thỏa thuận của các phép đo trong các điều kiện quy định. Độ chính xác được mô tả bằng các phương pháp thống kê như SD hoặc giới hạn tin cậy (). Từ định nghĩa về độ chính xác, rõ ràng là tham số qPCR này là định lượng. Để xác định độ chụm trong thực tế, hai điều kiện được gọi là độ lặp lại và độ tái lập đã được giới thiệu (). Hai thông số này được sử dụng để mô tả sự thay đổi của các phép đo được đưa ra bởi người vận hành, thiết bị và hiệu chuẩn của nó, các yếu tố môi trường có thể ảnh hưởng đến phép đo như nhiệt độ, độ ẩm, v.v. , và thời gian giữa các lần đo ( ). Độ lặp lại được mô tả là mức độ gần giống nhau giữa các kết quả liên tiếp và độc lập thu được bằng cùng một phương pháp trên cùng một vật liệu thử nghiệm trong cùng điều kiện (thiết bị, người thực hiện, phòng thí nghiệm và khoảng thời gian ngắn) và biểu thị các biến thể trong phòng thí nghiệm (, , ). Độ lặp lại bao gồm hai biến khác nhau. biến thể trong và giữa các xét nghiệm. Biến thể trong quá trình xét nghiệm mô tả tính biến thiên của các lần lặp lại được thực hiện trong cùng một thí nghiệm; . Về số lượng, độ lặp lại được đặc trưng là SD của các lần sao chép ở mỗi nồng độ của mỗi chất nền đối với mỗi phương pháp (). Khoảng được đặc trưng bởi SD của các lần lặp lại được gọi là giới hạn lặp lại (r) và được định nghĩa là giá trị nhỏ hơn hoặc bằng chênh lệch tuyệt đối dự kiến, với xác suất 95%, giữa hai kết quả thử nghiệm thu được trong các điều kiện lặp lại (, . Nếu giá trị đo nằm ngoài SD, nó nên được coi là nghi ngờ (). Cần thực hiện ước lượng độ lặp lại trên 15 lần lặp lại ít nhất ( , ). Thử nghiệm độ lặp lại yêu cầu phân tích ma trận có liên quan tăng vọt ít nhất ở bốn mức—cao, trung bình, thấp (gần LOD) và âm tính trong ít nhất các bản sao (). Để thử nghiệm nghiêm ngặt hơn, nên sử dụng năm lần lặp lại và bổ sung thêm một mẫu với chủng đối thủ cạnh tranh cho kết quả tương tự trong hệ thống phát hiện nhất định. Hệ vi sinh nền tự nhiên có thể đáp ứng yêu cầu này miễn là chúng có mặt trong chất nền ở mức 1 Log10 lớn hơn chất phân tích đích (). Trong phát hiện vi sinh vật lâm sàng, thú y và thực phẩm, không có khuyến nghị cụ thể nào về giá trị độ lặp lại SD xét về tỷ lệ của nó so với giá trị trung bình. Khi phát hiện GMO, độ lặp lại SD phải được thiết lập ≤25% trên các mẫu chứa 0. 1% GM liên quan đến phần khối lượng của vật liệu GM (; )

Mặt khác, độ tái lập là mức độ gần giống nhau giữa các kết quả thử nghiệm đơn lẻ trên vật liệu thử nghiệm giống hệt nhau, sử dụng cùng một phương pháp, thu được ở các phòng thí nghiệm khác nhau, sử dụng các thiết bị khác nhau và thể hiện sự thay đổi giữa các phòng thí nghiệm (, , ). Về số lượng, độ tái lập được đặc trưng khi SD sao chép ở từng nồng độ cho từng chất nền trong tất cả các phòng thí nghiệm (). Tương tự như độ lặp lại, giới hạn tái lập (R), là khoảng được đặc trưng bởi SD của các lần lặp lại, được định nghĩa là giá trị nhỏ hơn hoặc bằng giá trị mà chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm thu được trong các điều kiện tái lập dự kiến ​​sẽ có xác suất. . Nếu sự khác biệt giữa hai kết quả từ các phòng thí nghiệm khác nhau vượt quá R, kết quả phải được coi là nghi ngờ (). Độ tái lập thường được xác định bằng các nghiên cứu hợp tác, xác định tính biến thiên của các kết quả thu được bằng phương pháp đã cho trong các phòng thí nghiệm khác nhau sử dụng các mẫu giống hệt nhau (, ; ). Số lượng phòng thí nghiệm có kết quả hợp lệ nên được đưa vào nghiên cứu hợp tác ít nhất là tám. Do đó, nên chọn 10–12 phòng thí nghiệm (, ). Các yêu cầu đối với số lượng mẫu thử nghiệm tối thiểu giống hệt với xác định độ lặp lại (, ). Tương tự, không có khuyến nghị cụ thể nào về giá trị SD của độ tái lập liên quan đến giá trị trung bình trong phát hiện vi khuẩn lâm sàng, thú y và thực phẩm. Một lần nữa, trong thử nghiệm GMO, SD của khả năng tái tạo phải <35% trên toàn bộ dải động. Tuy nhiên, ở nồng độ tương đối <0. 2% hoặc với số lượng <100 bản sao Giá trị SD <50% được coi là chấp nhận được (; )

Mặc dù việc xác định độ chính xác của qPCR yêu cầu dữ liệu định lượng, nhưng cũng có khả năng xác định độ chính xác của phương pháp một cách định tính. Cơ chế xác định độ chính xác vẫn giống như đối với ước tính định lượng, bao gồm cả việc xác nhận trong các nghiên cứu hợp tác. Tuy nhiên, kết quả chỉ được đánh giá định tính (tích cực/tiêu cực). Cách tiếp cận này có thể được sử dụng để xác nhận phương pháp qPCR mới cụ thể trong các phòng thí nghiệm khác nhau, nhưng tốt hơn là nên sử dụng phương pháp này để xác nhận và kiểm soát thường quy các phương pháp qPCR khác nhau trong các phòng thí nghiệm khác nhau trên một tập hợp các mẫu tham chiếu. Các mẫu như vậy được cung cấp bởi một số cơ quan có thẩm quyền (phòng thí nghiệm tham chiếu) hoặc công ty tư nhân (QCMD), thu thập dữ liệu từ các phòng thí nghiệm khác nhau và trong trường hợp thành công, cung cấp giấy chứng nhận về việc tham gia thử nghiệm đó

Phần kết luận

Công nghệ qPCR đại diện cho một công cụ mạnh mẽ trong chẩn đoán vi sinh vật. Trong phát hiện, định lượng và đánh máy virus và ký sinh trùng, sự phù hợp của kỹ thuật này là không thể nghi ngờ; . Sự phổ biến của qPCR đến các lĩnh vực khác nhau của chẩn đoán vi sinh vật thông thường cùng với việc thiếu các quy trình chuẩn để xác định các thông số chức năng cơ bản của qPCR đã dẫn đến một kịch bản trong đó việc tiêu chuẩn hóa các phương pháp được thực hiện theo các quy tắc khác nhau bởi các phòng thí nghiệm khác nhau. Vấn đề này đã được giải quyết một phần bằng việc xuất bản hướng dẫn MIQE (); . Mọi đóng góp cho việc thống nhất các quy trình chuẩn hóa và xác nhận sẽ cải thiện chất lượng của các xét nghiệm qPCR trong việc phát hiện, định lượng và phân loại vi khuẩn

Sự đóng góp của tác giả

Cả hai tác giả được liệt kê, đã có những đóng góp đáng kể, trực tiếp và trí tuệ cho tác phẩm và đã phê duyệt nó để xuất bản

Kinh phí

Công việc được hỗ trợ bởi chương trình MA CR RO0516 và MEYS CR NPU I (LO1218). Nhà tài trợ không có vai trò gì trong thiết kế nghiên cứu, thu thập và giải thích dữ liệu hoặc quyết định gửi tác phẩm để xuất bản

Xung đột về tuyên bố lãi suất

Các tác giả tuyên bố rằng nghiên cứu được thực hiện trong trường hợp không có bất kỳ mối quan hệ thương mại hoặc tài chính nào có thể được hiểu là xung đột lợi ích tiềm tàng

Sự nhìn nhận

Các tác giả xin cảm ơn Neysan Donnelly (Viện Hóa sinh Max-Planck, CHLB Đức) đã sửa lỗi ngữ pháp cho bản thảo

Người giới thiệu

Vô Danh (1994). ISO 5725-1 - Độ chính xác (Độ đúng và độ chính xác) của các phương pháp và kết quả đo lường - Phần 1. Nguyên tắc chung và định nghĩa. Genève. ISO - Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế

Ẩn Danh (2009). Giao thức xác nhận các phương pháp vi sinh thay thế. Søborg. NordVal International/Ủy ban phân tích thực phẩm Bắc Âu, NMKL

Ẩn Danh (2011). ISO 16140 - Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Giao thức xác nhận các phương pháp thay thế. Genève. ISO - Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế

Vô Danh (2012). Hướng dẫn của Ủy ban Phương pháp để Xác nhận Phương pháp Vi sinh đối với Thực phẩm và Bề mặt Môi trường. Rockville, MD. QUỐC TẾ AOAC

Ẩn danh, R. (2013). Terrestrial Manual, 7th Edn, Chương 1. 1. 5. Nguyên tắc và phương pháp xác nhận các xét nghiệm chẩn đoán bệnh truyền nhiễm (Phiên bản được thông qua vào tháng 5 năm 2013). Paris. Tổ chức Thú y Thế giới

Google học giả

Ẩn danh, R. (2014). Nguyên tắc xác nhận của OIE, 3. 6. 5. Phương pháp thống kê để xác nhận. Paris. Tổ chức Thú y Thế giới

Google học giả

Ẩn danh, R. (2015a). Hướng dẫn Thẩm định Phương pháp Phân tích để Phát hiện mầm bệnh Vi sinh vật trong Thực phẩm và Thức ăn chăn nuôi, Tái bản lần 2. Mùa xuân bạc, MD. Cục Quản lý Thực phẩm & Dược phẩm Hoa Kỳ;

Google học giả

Ẩn danh, R. (2015b). Báo cáo kỹ thuật của JRC - Định nghĩa các yêu cầu hiệu suất tối thiểu đối với các phương pháp phân tích thử nghiệm GMO. Ispra. Ủy ban châu Âu, Trung tâm nghiên cứu chung;

Google học giả

Armbruster, D. Một. và Pry, T. (2008). Giới hạn mẫu trắng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. lâm sàng. hóa sinh. Tái bản. 29(Bổ sung. 1), S49–S52

Tóm tắt PubMed. Google học giả

bạch dương, l. , Dawson, C. e. , Cornett, J. h. và Keer, J. t. (2001). So sánh các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic để đánh giá khả năng sống của vi khuẩn. thư. ứng dụng. vi sinh vật. 33, 296–301. doi. 10. 1046/j. 1472-765X. 2001. 00999. xc

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Người môi giới, S. , Huber, tôi. , Grohmann, L. , Berben, G. , Taverniers, tôi. , Mazzara, M. , et al. (2014). Hướng dẫn thẩm định phương pháp real-time PCR định tính. Xu hướng khoa học thực phẩm. công nghệ. 37, 115–126. doi. 10. 1016/j. tifs. 2014. 03. 008

CrossRef Toàn văn. Google học giả

Bỏng, M. , và Valdivia, H. (2008). Mô hình hóa giới hạn phát hiện trong PCR định lượng thời gian thực. âu. Thực phẩm Res. công nghệ. 226, 1513–1524. doi. 10. 1007/s00217-007-0683-z

CrossRef Toàn văn. Google học giả

Bustin, S. Một. (2000). Định lượng tuyệt đối mRNA bằng cách sử dụng các xét nghiệm phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực. J. mol. nội tiết. 25, 169–193. doi. 10. 1677/jme. 0. 0250169

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Bustin, S. Một. , Benes, V. , Garson, J. Một. , Hellmans, J. , Huggett, J. , Kubista, M. , et al. (2009). Hướng dẫn MIQE. thông tin tối thiểu để công bố thí nghiệm PCR thời gian thực định lượng. lâm sàng. hóa. 55, 611–622. doi. 10. 1373/clinchem. 2008. 112797

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Triều Châu, M. , Bérard, A. , và Said, K. (2013). Định lượng tương đối trong phân tích GMO hạt giống. trạng thái nghệ thuật và tắc nghẽn. Res chuyển gen. 22, 461–476. doi. 10. 1007/s11248-012-9684-1

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Dreo, T. , Pirc, M. , Ramšak, Ž. , Pavšic, J. , Milavec, M. , Zel, J. , et al. (2014). Tối ưu hóa các phương pháp phân tích PCR kỹ thuật số giọt nhỏ để phát hiện và định lượng vi khuẩn. nghiên cứu điển hình về bệnh cháy lá và thối nâu khoai tây. hậu môn. sinh học. hóa. 406, 6513–6528. doi. 10. 1007/s00216-014-8084-1

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

tuôn ra, R. , Faraggi, D. , và Reiser, B. (2005). Ước tính Chỉ số Youden và điểm cắt liên quan của nó. sinh học. J. 47, 458–472. doi. 10. 1002/bimj. 200410135

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Higuchi, R. , Dollinger, G. , Walsh, P. S. và Griffith, R. (1992). Khuếch đại đồng thời và phát hiện các trình tự DNA cụ thể. Công nghệ sinh học 10, 413–417

Tóm tắt PubMed. Google học giả

Hoffmann, B. , Bia, M. , Reid, S. m. , Mertens, P. , Oura, C. Một. , van Rijn, P. Một. , et al. (2009). Đánh giá các công nghệ RT-PCR được sử dụng trong virus học thú y và kiểm soát dịch bệnh. chẩn đoán cụ thể và nhạy cảm đối với năm bệnh gia súc phải thông báo cho Tổ chức Thú y Thế giới. Bác sĩ thú y. vi sinh vật. 139, 1–23. doi. 10. 1016/j. thú y. 2009. 04. 034

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Hà Lan, P. m. , Abramson, R. Đ. , Watson, R. , và Gelfand, D. h. (1991). Phát hiện sản phẩm phản ứng chuỗi polymerase cụ thể bằng cách sử dụng hoạt động exonuclease 5′—3′ của Thermus Aquarus DNA polymerase. Proc. tự nhiên. học viện. Khoa học. bạn. S. A. 88, 7276–7280

Tóm tắt PubMed. Google học giả

Johnson, G. , Nolan, T. và Bustin, S. Một. (2013). PCR định lượng thời gian thực, phát hiện mầm bệnh và MIQE. phương pháp mol. Sinh học. 943, 1–16. doi. 10. 1007/978-1-60327-353-4_1

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Klein, Đ. (2002). Định lượng bằng công nghệ real-time PCR. ứng dụng và hạn chế. Xu hướng Mol. y tế. 8, 257–260. doi. 10. 1016/S1471-4914(02)02355-9

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Kralik, P. , Slana, tôi. , Kralova, A. , Babak, V. , Whitlock, R. h. , và Pavlik, tôi. (2011). Phát triển một mô hình dự đoán để phát hiện Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis trong phân bằng PCR định lượng thời gian thực. Bác sĩ thú y. vi sinh vật. 149, 133–138. doi. 10. 1016/j. thú y. 2010. 10. 009

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Kubista, M. , Andrade, J. m. , Bengtsson, M. , Forootan, A. , Jonak, J. , Lind, K. , et al. (2006). Phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực. mol. Khía cạnh Med. 27, 95–125. doi. 10. 1016/j. mẹ. 2005. 12. 007

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Levin, R. e. (2012). Phát hiện PCR nấm sinh aflatoxin và những hạn chế của nó. số nguyên. J. vi sinh vật thực phẩm. 156, 1–6. doi. 10. 1016/j. jfoodmicro. 2012. 03. 001

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Margot, H. , Zwietering, M. h. , Joosten, H. , O'Mahony, E. và Stephan, R. (2015). Đánh giá các canh thang tăng sinh dựa trên nước đệm peptone (BPW) khác nhau để phát hiện mầm bệnh gram âm từ thực phẩm từ các chất nền thực phẩm khác nhau. số nguyên. J. vi sinh vật thực phẩm. 214, 109–115. doi. 10. 1016/j. jfoodmicro. 2015. 07. 033

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Molenaar-de Backer, M. W. , de Waal, M. , Sjerps, M. C. và Koppelman, M. h. (2016). Xác nhận các xét nghiệm phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực mới để phát hiện RNA của virus viêm gan A và DNA của parvovirus B19. Truyền 56, 440–448. doi. 10. 1111/trf. 13334

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Nocker, A. , và Người cắm trại, A. K. (2009). Các phương pháp tiếp cận mới đối với việc phát hiện ưu tiên các tế bào khả thi bằng kỹ thuật khuếch đại axit nucleic. vi sinh FEMS. thư. 291, 137–142. doi. 10. 1111/j. 1574-6968. 2008. 01429. x

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Nocker, A. , Trương, C. Y. , và Người cắm trại, A. K. (2006). So sánh propidium monoazide với ethidium monoazide để phân biệt giữa sống và. vi khuẩn chết bằng cách loại bỏ có chọn lọc DNA từ các tế bào chết. J. vi sinh vật. Phương pháp 67, 310–320. doi. 10. 1016/j. kịch câm. 2006. 04. 015

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

hạt dẻ, S. , Doll, K. và Karlovsky, P. (2011). Xác định LOQ trong PCR thời gian thực bằng cách phân tích đường cong đặc tính hoạt động của máy thu. ứng dụng cho xét nghiệm qPCR đối với Fusarium verticillioides và F. tăng sinh. hậu môn. sinh học. hóa. 401, 717–726. doi. 10. 1007/s00216-011-5089-x

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Osei Sekyere, J. , Govinden, U. và Essack, S. Y. (2015). Rà soát các phương pháp phát hiện cải tiến và đã được thiết lập đối với vi khuẩn Gram âm sinh carbapenemase. J. ứng dụng. vi sinh vật. 119, 1219–1233. doi. 10. 1111/mứt. 12918

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Pavšič, J. , Devonshire, A. S. , Parkes, H. , Schimmel, H. , Foy, C. Một. , Karczmarczyk, M. , et al. (2015). Tiêu chuẩn hóa các xét nghiệm axit nucleic để đo vi khuẩn và vi rút lâm sàng. J. lâm sàng. vi sinh vật. 53, 2008–2014. doi. 10. 1128/JCM. 02136-14

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Pavšic, J. , Žel, J. và Milavec, M. (2016). Đánh giá PCR thời gian thực và các nền tảng PCR kỹ thuật số khác nhau để định lượng DNA. hậu môn. sinh học. hóa. 408, 107–121. doi. 10. 1007/s00216-015-9107-2

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Ricchi, M. , Savi, R. , Bolzoni, L. , Pongolini, S. , cấp, tôi. r. , De Cicco, C. , et al. (2016). Ước tính Mycobacterium avium subsp. tải lượng paratuberculosis trong sữa nguyên liệu thùng lớn ở Vùng Emilia-Romagna (Ý) bởi qPCR. Vi sinh mở 5, 551–559. doi. 10. 1002/mbo3. 350

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Rijsman, L. h. , Monkelbaan, J. F. , và Kusters, J. g. (2016). Hậu quả lâm sàng của chẩn đoán nhiễm ký sinh trùng đường ruột dựa trên PCR. J. tiêu hóa. gan. 31, 1808–1815. doi. 10. 1111/jgh. 13412

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Rodriguez-Lazaro, D. , Nấu ăn, N. , và Hernandez, M. (2013). PCR thời gian thực trong khoa học thực phẩm. chẩn đoán PCR. cà ri. Vấn đề Mol. Sinh học. 15, 39–44

Tóm tắt PubMed. Google học giả

Ruijter, J. m. , Ramakers, C. , Hoogaars, W. m. , Karlen, Y. , Thợ làm bánh, O. , van den Hoff, M. J. , et al. (2009). hiệu quả khuếch đại. liên kết đường cơ sở và sai lệch trong phân tích dữ liệu PCR định lượng. axit nucleic Res. 37. e45. doi. 10. 1093/nar/gkp045

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Saiki, R. K. , Gelfand, D. h. , Stoffel, S. , Scharf, S. J. , Higuchi, R. , Sừng, G. t. , et al. (1988). Khuếch đại DNA theo hướng mồi của enzyme với DNA polymerase ổn định nhiệt. Khoa học 239, 487–491

Tóm tắt PubMed. Google học giả

Saiki, R. K. , Scharf, S. , Falona, ​​F. , Mullis, K. b. , Sừng, G. t. , Erlich, H. Một. , et al. (1985). Khuếch đại enzym trình tự gen beta-globin và phân tích vị trí hạn chế để chẩn đoán bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm. Khoa học 230, 1350–1354

Tóm tắt PubMed. Google học giả

Slana, tôi. , Kralik, P. , Kralova, A. , và Pavlik, tôi. (2008). Sự lây lan của Mycobacterium avium subsp tại trang trại. paratuberculosis trong sữa nguyên liệu được nghiên cứu bởi IS900 và F57 PCR định lượng thời gian thực cạnh tranh và kiểm tra nuôi cấy. số nguyên. J. vi sinh vật thực phẩm. 128, 250–257. doi. 10. 1016/j. jfoodmicro. 2008. 08. 013

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Wazinger, F. , Ebner, K. , và Sư tử, T. (2006). Phát hiện và theo dõi nhiễm virus bằng real-time PCR. mol. Khía cạnh Med. 27, 254–298. doi. 10. 1016/j. mẹ. 2005. 12. 001

Tóm tắt PubMed. CrossRef Toàn văn. Google học giả

Dương, S. và Rothman, R. e. (2004). Chẩn đoán dựa trên PCR cho các bệnh truyền nhiễm. sử dụng, hạn chế và các ứng dụng trong tương lai trong môi trường chăm sóc cấp tính. Lây nhiễm Lancet. dis. 4, 337–348. doi. 10. 1016/S1473-3099(04)01044-8

Chất nào sau đây là nguồn thuốc thử phổ biến nhất cho quizlet anti A1?

Tại sao xét nghiệm D yếu cho phụ nữ mang thai không bắt buộc quizlet?

Kiểu gen nào sau đây được biết là có khả năng kháng Merozoites sốt rét P vivax?

Câu đố nào sau đây là nguyên nhân gây ra các phản ứng truyền máu tán huyết nghiêm trọng nhất đe dọa đến tính mạng?