PCR thời gian thực [PCR định lượng, qPCR] hiện là một phương pháp được thiết lập tốt để phát hiện, định lượng và phân loại các tác nhân vi sinh vật khác nhau trong các lĩnh vực chẩn đoán lâm sàng, thú y và an toàn thực phẩm. Mặc dù khái niệm về PCR tương đối đơn giản, nhưng có những vấn đề cụ thể trong qPCR mà các nhà phát triển và người sử dụng công nghệ này phải ghi nhớ. Chúng bao gồm việc sử dụng thuật ngữ và định nghĩa chính xác, hiểu nguyên tắc PCR, những khó khăn trong việc giải thích và trình bày dữ liệu, những hạn chế của qPCR trong các lĩnh vực chẩn đoán vi khuẩn khác nhau và các thông số quan trọng đối với mô tả hiệu suất của qPCR. Mục đích của chúng tôi trong bài đánh giá này không phải là mô tả mọi khía cạnh đơn lẻ của thiết kế, tối ưu hóa và xác thực qPCR;
Giới thiệu
Cụm từ “phản ứng chuỗi polymerase” [PCR] lần đầu tiên được sử dụng cách đây hơn 30 năm trong một bài báo mô tả quá trình khuếch đại DNA mới bằng enzyme []. Các ứng dụng đầu tiên của PCR khá phi thực tế do sử dụng đoạn Klenow không bền nhiệt để khuếch đại, đoạn này cần được thêm vào phản ứng sau mỗi bước biến tính. Sự đổi mới quan trọng cho phép sử dụng PCR thường xuyên là sử dụng polymerase ổn định nhiệt từ Thermus Aquaus []. Sự cải tiến này, cùng với sự sẵn có của các chu trình PCR và các thành phần hóa học, đã dẫn đến việc PCR được toàn thế giới công nhận là công cụ được lựa chọn để khuếch đại DNA bằng enzym cụ thể trong ống nghiệm. Cần lưu ý rằng khái niệm chung về PCR, bao gồm mồi, DNA polymerase, nucleotide, ion cụ thể và khuôn mẫu DNA, và bao gồm các chu kỳ bao gồm các bước biến tính DNA, ủ mồi và mở rộng, đã không thay đổi kể từ năm 1985. Việc phát minh ra PCR đã thúc đẩy mạnh mẽ nghiên cứu trong các lĩnh vực sinh học khác nhau và công nghệ này đã góp phần đáng kể vào trình độ hiểu biết hiện tại của con người trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu.
Cột mốc quan trọng nhất trong việc sử dụng PCR là sự ra đời của khái niệm giám sát quá trình khuếch đại DNA trong thời gian thực thông qua giám sát huỳnh quang [; ]. Trong PCR thời gian thực [còn được ký hiệu là PCR định lượng—qPCR; việc sử dụng RT-PCR là không phù hợp vì chữ viết tắt này được dành riêng cho PCR phiên mã ngược], huỳnh quang được đo sau mỗi chu kỳ và cường độ của tín hiệu huỳnh quang phản ánh lượng DNA nhất thời . Trong các chu kỳ ban đầu, huỳnh quang quá thấp để có thể phân biệt được với nền. Tuy nhiên, điểm mà tại đó cường độ huỳnh quang tăng trên mức có thể phát hiện được tương ứng với số lượng ban đầu của phân tử DNA mẫu trong mẫu. Điểm này được gọi là chu kỳ định lượng [Cq; các nhà sản xuất thiết bị qPCR khác nhau sử dụng thuật ngữ riêng của họ, nhưng kể từ năm 2009, thuật ngữ Cq được sử dụng riêng] và cho phép xác định số lượng tuyệt đối của DNA đích trong mẫu theo đường chuẩn được xây dựng
Hơn nữa, qPCR cũng có thể cung cấp kết quả bán định lượng mà không cần tiêu chuẩn nhưng có kiểm soát được sử dụng làm tài liệu tham khảo. Trong trường hợp này, các kết quả quan sát có thể được biểu thị dưới dạng bội số cao hơn hoặc thấp hơn với tham chiếu đến kiểm soát. Ứng dụng này của qPCR đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu biểu hiện gen [], nhưng không đạt được thành công tương tự trong định lượng vi sinh vì nó không thể tạo ra các giá trị định lượng tuyệt đối
Có hai chiến lược để hiển thị thời gian thực các đoạn DNA được khuếch đại—thuốc nhuộm DNA huỳnh quang không đặc hiệu và mẫu dò oligonucleotide được đánh dấu huỳnh quang. Hai phương pháp này được phát triển song song [; ] và được sử dụng để phát hiện mầm bệnh; . Điều này là do tính đặc hiệu cao hơn của nó được trung gian bởi oligonucleotide bổ sung—đầu dò—và độ nhạy thấp hơn để hình dung các sản phẩm PCR không đặc hiệu, e. g. , bộ điều chỉnh độ sáng mồi [; ]
Để hiểu đầy đủ các khả năng của qPCR trong việc phát hiện và định lượng DNA mục tiêu trong các mẫu, điều cần thiết là phải mô tả nguyên tắc toán học của phương pháp này. PCR là một quá trình theo cấp số nhân, trong đó số lượng phân tử DNA về mặt lý thuyết tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ [nếu hiệu suất của phản ứng là 100%]. Tổng quát hơn, phản ứng khuếch đại tuân theo phương trình này
Nn = N0 × [1 + E]n [1]
trong đó Nn là số lượng bộ khuếch đại PCR sau n chu kỳ, N0 là số bản sao khuôn mẫu ban đầu trong mẫu, E là hiệu suất PCR có thể nhận các giá trị trong khoảng từ 0 đến 1 [0–100%] và n là số . Trong trường hợp ban đầu có một bản sao của mẫu trong phản ứng và hiệu suất PCR là 100%, có thể đơn giản hóa phương trình như sau
Nn = 2n [2]
Nếu chạy đường chuẩn, thường sử dụng pha loãng nối tiếp 10 lần. Sự khác biệt về giá trị Cq giữa hai độ pha loãng nối tiếp 10 lần có thể được biểu thị bằng
10= 2n [3]
Khi đó n = 3. 322. Khi E nên được xác định [1] là điểm bắt đầu và phương trình là
E = 10−[1n] − 1 [4]
Nếu lấy n là 3. 322 thì E = 1, i. e. , 100%
Do đó, hiệu quả PCR là một yếu tố quan trọng để định lượng DNA mục tiêu trong các mẫu chưa biết. Độ tin cậy của đường chuẩn trong việc cho phép định lượng sau đó được xác định bởi khoảng cách của các độ pha loãng nối tiếp. Nếu Log10 của nồng độ hoặc số lượng bản sao của mỗi chất chuẩn được vẽ dựa trên giá trị Cq của nó [Hình 1], thì E có thể được suy ra từ phương trình hồi quy mô tả hàm tuyến tính
y = kx + c [5]
Trong đó x và y lần lượt là nồng độ/lượng của mục tiêu và giá trị Cq, đặc trưng cho tọa độ trong biểu đồ, k là hệ số hồi quy hoặc độ dốc và c là hệ số chặn. Lấy phương trình hồi quy mô hình từ Hình , hệ số góc là −3. 322, nghĩa là E = 100% theo [4]. Chặn hiển thị giá trị Cq khi một bản sao sẽ được phát hiện về mặt lý thuyết [; ]. Sau đó, nồng độ hoặc lượng axit nucleic mục tiêu trong các mẫu chưa biết được tính theo giá trị Cq thông qua Công thức [5]
HÌNH 1
Hình 1. Lập mô hình đường chuẩn với phương trình hồi quy [đặc trưng bởi hệ số góc và tung độ gốc] và hệ số hồi quy
Từ các định nghĩa trên, rõ ràng là các giá trị Cq là số đọc của thiết bị và phải được tính toán lại thành các giá trị với các đơn vị cụ thể, e. g. , bản sao của sinh vật, ng của DNA, nồng độ khác nhau, v.v. , [; ]. Tuy nhiên, việc đề cập đến các giá trị Cq trong các bài báo khoa học là phổ biến và việc giải thích dựa trên các giá trị Cq có thể dẫn đến kết luận sai lệch. Nồng độ trong qPCR được biểu thị theo thang logarit [Hình ] và sự khác biệt về Cq giữa các độ pha loãng nối tiếp 10 lần về mặt lý thuyết luôn là 3. 322 chu kỳ. Do đó, mặc dù sự khác biệt về số giữa Cq 20 và 35 là không đáng kể, nhưng sự khác biệt về số thực [bản sao, ng] gần bằng năm bậc độ lớn [Log10]
Tính năng này phải được phản ánh trong các tính toán tiếp theo. Ví dụ: hệ số biến thiên [CV, tỷ lệ giữa độ lệch chuẩn và giá trị trung bình] được tính toán từ các giá trị Cq và số thực dẫn đến các kết quả rất khác nhau. Điều tương tự cũng áp dụng cho bất kỳ thử nghiệm thống kê nào sử dụng giá trị Cq, ngay cả đối với trường hợp logarit của giá trị Cq được sử dụng để chuẩn hóa dữ liệu trước khi đánh giá thống kê. Quy trình đúng phải bao gồm phép tính lại ban đầu thành số thực, sau đó là phép biến đổi logarit
Ưu và nhược điểm của việc sử dụng qPCR trong phát hiện và định lượng mầm bệnh
Vì PCR có khả năng khuếch đại một đoạn DNA cụ thể nên nó đã được sử dụng trong chẩn đoán mầm bệnh. Với số lượng dữ liệu giải trình tự ngày càng tăng, theo nghĩa đen, có thể thiết kế các xét nghiệm qPCR cho mọi vi sinh vật [nhóm và phân nhóm vi sinh vật, v.v. ] lãi. Ưu điểm chính của qPCR là nó cung cấp khả năng phát hiện và định lượng nhanh và thông lượng cao các trình tự DNA mục tiêu trong các nền khác nhau. Thời gian khuếch đại thấp hơn được tạo điều kiện thuận lợi bằng cách khuếch đại đồng thời và trực quan hóa các bộ khuếch đại DNA mới được hình thành. Hơn nữa, qPCR an toàn hơn trong việc tránh lây nhiễm chéo vì không cần thao tác thêm với các mẫu sau khi khuếch đại. Các ưu điểm khác của qPCR bao gồm dải động rộng để định lượng [7–8 Log10] và ghép kênh khuếch đại của một số mục tiêu vào một phản ứng duy nhất []. Tùy chọn ghép kênh là điều cần thiết để phát hiện và định lượng trong các xét nghiệm qPCR chẩn đoán dựa trên việc bao gồm các điều khiển khuếch đại bên trong [; ; ]
Các xét nghiệm qPCR không chỉ được sử dụng để phát hiện mà còn để xác định sự hiện diện của các gen và alen cụ thể, chẳng hạn như. g. , định loại chủng và phân lập, lập hồ sơ kháng kháng sinh, sản xuất độc tố, v.v. , Tuy nhiên, sự hiện diện đơn thuần của các gen chịu trách nhiệm kháng các hợp chất chống vi trùng hoặc sản xuất độc tố nấm không tự động có nghĩa là chúng biểu hiện hoặc sản xuất. Do đó, mặc dù các bài kiểm tra đánh máy dựa trên qPCR nhanh hơn nhưng kết quả của chúng phải tương quan với các bài kiểm tra kiểu hình và sinh hóa [; ]
Đối với chẩn đoán vi sinh vật, có những cân nhắc khác nhau trong việc phát hiện và định lượng các tác nhân vi rút, vi khuẩn và ký sinh trùng. Những cân nhắc này dựa trên mục tiêu [DNA hoặc RNA], khả năng nuôi cấy, giải thích kết quả và ý nghĩa lâm sàng của kết quả qPCR
qPCR đóng một vai trò quan trọng trong việc phát hiện, định lượng và định loại mầm bệnh virus. Điều này là do việc phát hiện các loại vi rút lâm sàng và thú y quan trọng bằng phương pháp nuôi cấy là tốn thời gian hoặc không thể, trong khi các xét nghiệm ELISA không phổ biến và có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đối thấp. qPCR [bao gồm phiên mã ngược để chẩn đoán virus RNA] cung cấp độ nhạy và độ đặc hiệu thích hợp []. Ngoài ra, việc xác định tải lượng vi-rút bằng [RT]-qPCR được sử dụng như một chỉ báo về đáp ứng với các liệu pháp kháng vi-rút []. Vì những lý do này [RT]-qPCR đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong chẩn đoán virus []
Tình hình tương tự trong trường hợp chẩn đoán đơn bào đường ruột []. Kỹ thuật tiêu chuẩn vàng để phát hiện các tác nhân đơn bào, kiểm tra phân bằng kính hiển vi, tốn nhiều công sức, thời gian và yêu cầu nhân viên được đào tạo đặc biệt. Tương tự, xét nghiệm ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp []. Do đó, qPCR hiện đang nổi lên như một công cụ mạnh mẽ trong việc phát hiện, định lượng và định loại các động vật nguyên sinh ký sinh đường ruột.
Trái ngược với việc phát hiện và định lượng virus và động vật nguyên sinh, nhiều loại vi khuẩn có ý nghĩa lâm sàng, thú y và an toàn thực phẩm có thể được nuôi cấy. Vì lý do này, nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn vàng trong phát hiện và định lượng vi khuẩn. Tuy nhiên, trong những trường hợp cần can thiệp quan trọng và kịp thời đối với bệnh truyền nhiễm, các kỹ thuật nuôi cấy truyền thống, chậm và nhiều bước không thể mang lại kết quả trong thời gian hợp lý. Hạn chế này được kết hợp bởi sự cần thiết phải nuôi cấy mầm bệnh khó tính và thử nghiệm bổ sung [xác định loài, xác định các yếu tố độc lực và kháng thuốc kháng sinh]. qPCR có khả năng cung cấp thông tin cần thiết trong thời gian ngắn;
Về an toàn thực phẩm, tất cả các tiêu chuẩn quốc tế về chất lượng thực phẩm đều dựa vào việc xác định vi sinh vật gây bệnh bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống. Các kỹ thuật qPCR đại diện cho một giải pháp thay thế tuyệt vời cho các phương pháp nuôi cấy tiêu chuẩn hiện có vì chúng cho phép phát hiện và định lượng đáng tin cậy [đối với một số mầm bệnh] và có nhiều lợi thế khác như đã thảo luận ở trên. Tuy nhiên, có những hạn chế liên quan đến độ nhạy của các xét nghiệm dựa trên qPCR. Vì các phương pháp nuôi cấy dựa vào sự nhân lên của vi khuẩn trong các bước tiền nuôi cấy [tiền tăng sinh], các mẫu để phân lập DNA ban đầu thường chứa số lượng vi khuẩn mục tiêu rất thấp []. Hạn chế này dẫn đến nhược điểm quan trọng nhất của qPCR, đó là khả năng phân biệt giữa tế bào sống và tế bào chết vốn có của nó. Do đó, việc sử dụng qPCR chỉ giới hạn trong việc phân loại các chủng vi khuẩn, xác định khả năng kháng kháng sinh, phát hiện và có thể định lượng trong thực phẩm thô và chưa chế biến. Điều quan trọng cần lưu ý là thực phẩm đã qua chế biến vẫn có thể chứa DNA có thể khuếch đại ngay cả khi tất cả các vi khuẩn có khả năng gây bệnh trong thực phẩm đã bị khử và thực phẩm an toàn về mặt vi sinh để tiêu thụ []. Để khắc phục vấn đề này, có thể đặt tiền tăng sinh mẫu trong môi trường nuôi cấy trước qPCR. Bước này có thể bao gồm tăng sinh không chọn lọc trong nước đệm peptone hoặc môi trường chọn lọc cụ thể cho vi khuẩn tương ứng. Quy trình này chủ yếu nhằm mục đích cho phép hồi sức/phục hồi và nhân lên sau đó của vi khuẩn để phát hiện qPCR xuôi dòng; . ]. Việc chiết xuất DNA từ môi trường nuôi cấy dễ dàng hơn so với từ các mẫu thực phẩm, chúng không đồng nhất hơn nhiều về thành phần []
Mặc dù bản thân qPCR không thể phân biệt giữa các tế bào chết và tế bào sống, các nỗ lực đã được thực hiện để điều chỉnh qPCR nhằm phát hiện khả năng sống. Người ta đã chứng minh rằng RNA có độ ổn định thấp và sẽ bị phân hủy trong các tế bào chết trong vòng vài phút. Tuy nhiên, mối tương quan giữa khả năng tồn tại của tế bào với sự tồn tại của các loại axit nucleic phải được đặc trưng rõ ràng cho một tình huống cụ thể trước khi phương pháp phân tích dựa trên khuếch đại thích hợp có thể được áp dụng làm phương pháp thay thế cho các kỹ thuật nuôi cấy truyền thống hơn []. Hơn nữa, những khó khăn liên quan đến việc phân lập RNA từ các mẫu như thực phẩm, phân hoặc mẫu môi trường có thể cho kết quả âm tính giả, đặc biệt khi số lượng tế bào đích dự kiến thấp
Một tùy chọn khác để xác định khả năng tồn tại bằng cách sử dụng qPCR là triển khai thuốc nhuộm huỳnh quang xen kẽ như propidium monoazide [PMA] và ethidium monoazide [EMA; ]. Trong các phương pháp này, tiêu chí để xác định khả năng tồn tại là tính toàn vẹn của màng. Các tế bào hoạt động trao đổi chất [bất kể khả năng nuôi cấy của chúng] với tính toàn vẹn của màng giữ cho thuốc nhuộm bên ngoài tế bào và do đó được coi là khả thi. Tuy nhiên, nếu tính toàn vẹn của màng sinh chất bị tổn hại, thuốc nhuộm sẽ thâm nhập vào tế bào hoặc phản ứng với DNA bên ngoài tế bào chết. Sau đó, DNA được dán nhãn không có sẵn để khuếch đại bởi qPCR và sự khác biệt giữa các tế bào được xử lý và không được xử lý cung cấp thông tin về tỷ lệ các tế bào khả thi trong mẫu. Hạn chế của phương pháp này là cần phải có các ô trong một ma trận trong suốt ánh sáng, e. g. , mẫu nước, nuôi cấy tế bào, v.v. , vì sự xen kẽ của thuốc nhuộm với DNA đòi hỏi phải tiếp xúc với ánh sáng. Do đó, các mẫu không đủ độ trong suốt ánh sáng không cho phép sử dụng các thuốc nhuộm này. Người ta ưu tiên PMA hơn EMA, vì người ta đã chứng minh rằng EMA thâm nhập vào màng tế bào vi khuẩn sống []
Ngoài ra, một chủ đề khác mà chúng tôi muốn đề cập ở đây là việc tạo ra và sử dụng các tiêu chuẩn cần thiết cho các đường chuẩn. Nói chung, có hai cách tiếp cận phổ biến nhất để tạo ra các đường chuẩn. Một sử dụng sự pha loãng của axit nucleic bộ gen mục tiêu và các tiêu chuẩn plasmid khác. Cả hai chiến lược đều có thể dẫn đến định lượng mục tiêu cuối cùng, nhưng các plasmid chứa trình tự mục tiêu cụ thể mang lại lợi thế là sản xuất dễ dàng, ổn định và rẻ. Mặt khác, về nguyên tắc, hiệu quả PCR thu được theo tiêu chuẩn plasmid đôi khi có thể khác so với hiệu quả thu được khi sử dụng tiêu chuẩn gen, mà thay vào đó, đối với các sinh vật khó phát triển, chỉ có thể được phân lập bắt đầu từ một chất nền nhất định và do đó dễ bị phân hủy. . Cuối cùng, việc sản xuất và xác nhận các tiêu chuẩn định lượng quốc tế cho các xét nghiệm qPCR đòi hỏi kỹ thuật cao và các tiêu chuẩn này hiện chỉ khả dụng cho một số mục tiêu []
Thông số qPCR trong Phát hiện và Định lượng Vi sinh vật
Độ đặc hiệu phân tích [Tính chọn lọc]
Tham số này trong qPCR đề cập đến tính đặc hiệu của đoạn mồi cho mục tiêu quan tâm. Tính đặc hiệu phân tích bao gồm hai khái niệm. tính toàn diện mô tả khả năng của phương pháp phát hiện nhiều loại mục tiêu với mức độ liên quan được xác định e. g. , phân loại, miễn dịch, thành phần di truyền [, ]. Một định nghĩa khác mô tả tính toàn diện là các chủng hoặc phân lập của [các] chất phân tích đích mà phương pháp có thể phát hiện []. ISO 16140 và các tiêu chuẩn khác khuyến nghị rằng tính bao gồm nên được xác định trên 20–50 chủng được xác định rõ [được chứng nhận] của sinh vật đích [, , , ; ], hoặc đối với Salmonella, khuyến nghị nên bao gồm 100 serovar để thử nghiệm tính bao gồm [
Mặt khác, tính độc quyền mô tả khả năng của phương pháp phân biệt mục tiêu với các mục tiêu không phải là mục tiêu tương tự nhưng khác biệt về mặt di truyền. Nói cách khác, tính độc quyền cũng có thể được định nghĩa là không có sự can thiệp từ một loạt các chủng không phải mục tiêu có liên quan, có khả năng phản ứng chéo [ , , , ]. Số lượng mẫu dương tính mong muốn trong xét nghiệm độc quyền là 0 []
Độ nhạy phân tích [Giới hạn phát hiện, LOD]
Nhiều tài liệu chính thức đã thảo luận về các lý thuyết và quy trình để định nghĩa chính xác LOD cho các phương pháp khác nhau. Một sự đồng thuận chung đã đạt được xung quanh định nghĩa LOD là lượng chất phân tích thấp nhất, có thể được phát hiện với độ tin cậy cao hơn một tỷ lệ phần trăm đã nêu, nhưng không nhất thiết phải được định lượng thành một giá trị chính xác [, , ]. Về vấn đề này, mức độ tin cậy đạt được hoặc được yêu cầu cho định nghĩa LOD có thể phản ánh số lần lặp lại [cả kỹ thuật và thử nghiệm] mà xét nghiệm cần để đạt được mức độ tin cậy được yêu cầu [e. g. , 95%]. Rõ ràng là càng nhiều lần lặp lại thì khoảng tin cậy càng hẹp. Một định nghĩa khác mô tả LOD là mức nồng độ thấp nhất có thể được xác định là khác biệt về mặt thống kê so với mẫu trắng ở mức độ tin cậy xác định. Giá trị này phải được xác định từ việc phân tích mẫu trắng và mẫu ở các mức gần LOD dự kiến []. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng các định nghĩa LOD được mô tả ở trên đã được báo cáo cho các phương pháp hóa học và không hoàn toàn phù hợp với các phương pháp PCR []. Điều này là do, đối với nồng độ giới hạn của chất phân tích [axit nucleic], đầu ra của phản ứng có thể thành công [khuếch đại] hoặc thất bại [không khuếch đại gì cả], không có mẫu trắng hoặc mức tới hạn nào có thể đạt được. . Hơn nữa, cần nhớ ở đây rằng, theo định nghĩa, một mẫu trắng không bao giờ dương tính trong PCR.
Vì các định nghĩa được báo cáo ở trên không thể thực hiện được đối với PCR, nên các phương pháp khác đã được đề xuất. Một cách tiếp cận thận trọng là coi giá trị LOD là nồng độ tối thiểu của axit nucleic hoặc số lượng tế bào, luôn cho kết quả PCR dương tính trong tất cả các lần lặp lại được thử nghiệm hoặc trong phần lớn [hơn 95%] trong số chúng []. Trong thực tế, nhiều phần của một chất nền cụ thể được thêm vào các độ pha loãng nối tiếp của sinh vật đích và trải qua toàn bộ quá trình phân lập axit nucleic và qPCR. Sau đó, LOD được định nghĩa là lượng vi sinh vật đích tăng đột biến ở dạng pha loãng có thể được phát hiện trong 95% số lần lặp lại. Ví dụ, 10 mẫu sữa lặp lại được bổ sung thêm Campylobacter jejuni pha loãng nối tiếp với số lượng 105–100 tế bào trên 1 ml sữa. LOD được xác định bằng thực nghiệm của phương pháp phát hiện C. jejuni trong sữa xấp xỉ 1. 56 × 103 tế bào/ml sữa [Hình ]. Để xác định rõ hơn giá trị chính xác nhất, có thể thử nghiệm nhiều độ pha loãng hơn trước khi đạt đến giá trị LOD cuối cùng càng gần giá trị thực càng tốt. Số lần lặp lại thử nghiệm ít nhất phải là sáu [; ];
HÌNH 2
Hình 2. Biểu diễn đồ họa của việc xác định giới hạn phát hiện [LOD] trong qPCR. Dữ liệu trong bảng hiển thị số lượng mẫu dương tính/tất cả các mẫu được phân tích [tỷ lệ tín hiệu]
Theo phân phối Poisson, người ta kết luận rằng LOD cho PCR không thể thấp hơn ít nhất ba bản sao của mục tiêu axit nucleic [; ]. Tuy nhiên, giá trị này đề cập đến LOD lý thuyết của phương pháp qPCR, có khả năng phát hiện một phân tử DNA đích duy nhất trong mẫu. Giả sử điều này, LOD như vậy cho tất cả các xét nghiệm qPCR được tối ưu hóa sẽ giống nhau. Do đó, như đã nêu ở trên, LOD phải liên quan đến toàn bộ phương pháp bao gồm chuẩn bị axit nucleic và qPCR. Chỉ trong những điều kiện này, nó mới có thể biểu thị một tham số hợp lệ mô tả các tính năng của phương pháp qPCR tương ứng []
Tuy nhiên, đôi khi không thể có được số lượng lớn các bản sao, vì cả lý do tài chính và kỹ thuật. Để khắc phục những vấn đề này, ngày càng có nhiều báo cáo sử dụng phương pháp Probit hoặc Logit để xác định LOD cho phương pháp PCR [; ; ;]. Tóm lại, cả hai hàm toán học đều là hồi quy được sử dụng để phân tích các biến phản ứng nhị thức [dương hoặc âm] và có thể biến đổi đường cong phản ứng liều lượng sigmoid, điển hình của một biến nhị thức, thành một đường thẳng mà sau đó có thể được phân tích bằng hồi quy thông qua ít nhất . Điểm cuối cùng của phân tích là nồng độ [cùng với khoảng tin cậy tương đối], liên quan đến xác suất [e. g. , 95%] để phát hiện axit nucleic. Hơn nữa, hồi quy Probit chỉ có thể khai thác đối với dữ liệu được phân phối bình thường, trong khi chức năng Logit cũng có thể được sử dụng cho dữ liệu không được phân phối bình thường;
Cuối cùng, cần lưu ý rằng LOD không phải là giá trị giới hạn và do đó, các giá trị Cq bên dưới LOD không thể tự động được coi là âm. Từ định nghĩa của LOD, rõ ràng là các giá trị bên dưới LOD hoàn toàn hợp lệ về sự hiện diện của vi sinh vật; . Tính năng này được kết nối với phân phối Poisson khi làm việc với số lượng nhỏ
Giới hạn định lượng [LOQ]
Các tài liệu đã được trích dẫn cho các định nghĩa LOD cũng chứa các định nghĩa tương tự cho LOQ. LOQ được định nghĩa là lượng chất phân tích nhỏ nhất, có thể được đo và định lượng với độ chính xác và độ chính xác xác định trong các điều kiện thí nghiệm bằng phương pháp được xác nhận [; , ]. Một định nghĩa khác là LOQ là lượng hoặc nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể được xác định định lượng với mức độ không chắc chắn có thể chấp nhận được []. Rõ ràng là, theo các định nghĩa trước đó, LOQ không bao giờ được thấp hơn LOD
Trong thực tế, LOQ được xác định giống như LOD, trên các bản sao của các mẫu thêm chuẩn, nhưng việc đánh giá kết quả là định lượng. Về số lượng, LOQ được định nghĩa là nồng độ thấp nhất của chất phân tích, mang lại độ biến thiên được xác định trước, thường được báo cáo là hệ số biến thiên [CV]. Đối với qPCR, giá trị này đã được đề xuất cố định dưới 25% [; ; ; ], lưu ý rằng các giá trị Cq phải được tính toán lại cho các bản sao hoặc g axit nucleic trước khi thực hiện đánh giá CV [; ]. Hoverer, giá trị này được đề xuất dựa trên kinh nghiệm tích lũy được trong các phòng thí nghiệm phát hiện GMO [; ] và không có thỏa thuận chung nào về bất kỳ tiêu chuẩn kỹ thuật nào đối với các phương pháp phân tử trong vi sinh học. Do đó, ở đây chúng tôi đề xuất định nghĩa LOQ trong chẩn đoán phân tử vi sinh vật là nồng độ, số lượng hoặc số lượng chất phân tích thấp nhất có CV